Сравнительный анализ токсичности метиленового синего и профлавина для сапрофитных бактерий и фотодинамическое обеззараживание воды

Пурцхванидзе Виолетта Александровна

К.б.н., главный врач медицинского центра высоких технологий «Лазервита», г Москва

Симаков Юрий Георгиевич

Д.б.н., профессор, Московский государственный университет технологий и управления им. К. Г. Разумовского, г. Москва

Баткаева Надежда Владимировна

Научный сотрудник, РУДН, г. Москва

COMPARATIVE ANALYSIS OF THE TOXICITY OF METHYLENE BLUE AND PROFLAVINE FOR SAPROPHYTIC BACTERIA AND PHOTODYNAMIC-DECONTAMINATION OF WATER V. Purtskhvanidze Y. Simakov N. Batkayeva Summary. A comparative analysis of the toxicity of aqueous solutions of methylene blue and proflavine photodynamic treatment with fluorescent lamps, with 3 thousand Lux. such biological indicators of saprophytic bacteria as BOD5 and the increase in the number of bacteria. It is shown that methylene blue at lower concentrations than proflavine exhibits phototoxicity to saprophytic bacteria in the water from a natural body of water (allowable concentration for methylene blue on such indicators as the change in BOD5 and growth of bacteria in ml of pond water were the same. 0.01 mg/l, and PF, respectively, 0.05 and 0.1 mg/l). From the point of view of phototoxicity of substances for disinfection of water in large volumes is economically advantageous to use methylene blue. Keywords: methylen blue, proflavine, phototoxicity, BOD5, growth of bacteria, photodynamic-decontamination of water.

Аннотация. Проведен сравнительный анализ токсичности водных растворов метиленового синего и профлавина при фотодинамическом воздействии лампами дневного света при 3 тыс. лк. на такие биологические показатели сапрофитных бактерий как БПК5 и прирост численности бактерий. Показано, что метиленовый синий при меньших концентрациях, чем профлавин проявляет фототоксичность для сапрофитных бактерий в воде из природного водоема (допустимая концентрация для метиленового синего по таким показателям как изменение БПК5 и прирост бактерий в мл прудовой воды оказалось оди- наковой. равной 0,01 мг/л, а для профлавина соответственно 0,05 и 0,1 мг/л). С точки зрения фототоксичности веществ для обеззараживания воды в больших объемах экономически выгоднее применять метиленовый синий. Ключевые слова. Метиленовй синий, профлавин, фототоксичность, БПК5, прирост бактерий, фотодинамическое обеззараживание воды.

Обеззараживания воды остается одной из важнейших проблем в экологии при охране окружающей среды и защите населения от биологического загрязнения. В настоящее время наблюдается всемирная тенденция, направленная на улучшение водоснабжения населения, характеризуются растущим пониманием необходимости бережного, рационального отношения к водным ресурсам, совершенствованием технологии очистки воды.

При фотодинамическом обеззараживании воды широкое применение нашли фотосенсибилизаторы отно-сящиеся к азиновым красителям — метиленовый синий и профлавин. Выявлено, что указанные фотосенсибилизаторы обладают широким спектром воздействия и подавляют также развитие вирусов, цианобактерий и низших грибов. Тенденция использования различных красителей, обладающих фотосенсибилизирующими свойствами, для обеззараживания воды продолжает развиваться и далее ускоренными темпами [5, 6]. Однако в этом направлении есть еще много неизученных сторон, которые требуют своего неотложного решения. Одной из таких сторон является анализ сравнительной эффективности обеззараживания воды различными соединениями, обладающими фотосенсибилизирующими свойствами. Именно такой сравнительный ана-лиз фототоксичности двух соединений, метиленового синего и профлавина. проведен нами в данной работе. Оба вещества уже практически используются для обеззараживания воды, как в водоемах, так в аквариумистике. Для оценки эффективности воздействия каждого из фотосенсибилизаторов мы использовали сапрофитных бактерий в пробах воды из природных водоемов., а основными санитарными показателями, отвечающими за метаболизм и размножение бактерий, служили БПК5 и динамика прироста численности гетеротрофных бактерий.

Цель работы — провести сравнительный анализ токсичности фотосенсибилизаторов — метиленового синего и профлавина для сапрофитных бактерий для выявления наиболее перспективного соединения при фотодинамическом обеззараживании воды и установления пороговых значений, при которых проявляется фотодинамический эффект для бактерий.

1.Материалы и методы

Исследование проведено с двумя азиновыми красителями, обладающими фотосенсибилизирующим свойством: метиленовым синим и профлавином.

Для определения воздействия метиленового синего и профлавина на БПК5 использовали воду из пресноводного подмосковного водоема, где численность сапрофитных бактерий, определенная посевом на МПА, составляла 1,4*104 кл./мл. Растворы фотосенсибилизаторов для проведения опыта готовились в пластикових 5ти литровых бутылях. В каждую бутыль в качестве органической нагрузки вносился пептон (из такого расчета, чтобы на 5й день БПК составила около 5 мгО2/л). В опытные сосуды вносили исследуемое вещество не менее, чем в 5 концентрациях. Спектр исследуемых концентраций фотосенсибилизаторов подбирался исходя из литературных данных, о их действии на различные гидробионты [7. 8]. с таким расчетом, чтобы исследуемые концетрации шли в сторону завышения и в сторону занижения от пороговой концентрации. Поскольку исследовалось действие фотосенсибилизаторов, бутили с исследуемыми концентрациями находились при переменном освещении в люминостате при освещенности 3000 люкс с чередованием света и темноты через 12 часов. Один из сосудов служил контролем. В исходные сутки, а также по указанной ниже схеме, производился отбор проб в склянки (три повторности) для определения БПК до 5 суток в предварительном опыте и до седьмых суток включительно при проведении основного опыта.

Для стандартизации условий проведения опыта склянки с пробами для определения БПК ставились в темноту и находились в термостате при температуре 200 С. После экспозиции в каждом сосуде с пробой воды с помощью оксиметра («Экотест» с селективными электродамина О2) определяли содержание кислорода. Санитарноэкологические последствия присутствія в воде исследуемого вещества в различных концентрациях оценивали по его влиянию на БПК5 воды. Для каждого из веществ был взят свой спектр концентраций, который определялся предварительно на основании литературных данных и острых опытов на дафниях. БПК5 рассчитывали, как разность между исходной концентрацией кислорода в воде ([О2]исх) и концентрацией кислорода на соответствующий срок наблюдения ([О2]t):

БПК5 = [О2]исх-[О2]ь

Оценка эффекта токсичного вещества производится по сравнению величин БПК5 в опыте и в контрольном сосуде:

где БПК5 (оп) и БПК5 (контр) в опыте и в контроле, соответственно, на один и тот же срок.

В качестве недействующей концентрации принимали ту, при которой показатель БПК5 отклонялся от соответствующих значений в контроле не более чем на 20% (т. е. N < 20%) [9].

Для вычисления концентрации, вызывающей 20%ное отклонение, путем интерполяции использовал следующее уравнение:

где С — концентрация вещества, вызывающая отклонение значений БПК5 от аналогичных значений в контроле на 20%; C1 и С2 — концентрации загрязняющего вещества, вызвавшие отклонения БПК5 менее и болем чем на 20% соответственно;

1.2. Оценка влияния на рост сапрофитов

Для исследования динамики прироста гетеротрофных бактерий в растворах исследуемых красителей, использовали воду того же водоема, что и для определения БПК5. Подсчет бактерий проводился в пробах взятых из тех же сосудов с различными концентраціями красителей, которые использовались при определении влияния фототоксикантов на БПК5. Определение общего количества бактерий в различных вариантах опыта проводилось по ГОСТ 5216–50. Для этих целей определялось количество бактерий в 1 мл воды, способных расти на мясопептонном агаре. Подсчет колоний в чашках Петри проводили через 48 часов после посева. Сроки взятия проб воды для посевов на МПА соответствовали тем, которые указаны в «Методике по установлению рыбохозяйственных нормативов ПДК и ОБУВ [9]. Мясопептонный агар расплавляли в водяной бане, а затем охлаждали до 400С. После этого стерильной пробиркой отбиралась соответствующая проба и вносилась в 2 стерильные чашки Петри, затем следовала заливка мясопептонным агаром при перемешивании исследуемой воды вращательным движением. После остывания чашки Петри помещались вверх дном в термостат на 48 часа. Через 48 часов производили подсчет колоний на поверхности и в глубине агара. Достоверность разности средних показателей определялась по критерию Стьюдента [10].

2. Результаты исследований

2.1. Влияние метиленового синего на показатель БПК5

Опыты проводились в двух сериях с различающейся продолжительностью. В предварительном опыте испы­тания проводили при концентрациях метиленового си­него 1,0; 0,5; 0,1; 0,05 и 0,01мг/л.

Изменение БПК5 исследовалось в растворах фототок­сиканта сразу после постановки опыта и на 5 сутки после постановки опыта. Результаты исследований приведены в табл. 2.1.

Выделены значения, статистически достоверно отли­чающиеся от контроля по критерию Стьюдента (Р ≤ 0,05)

Анализ результатов, приведенных в таблице, сви­детельствует о том, что вещество в концентрациях 0,05 мг/л и выше в исходные сутки достоверно снижает БПК5 и выступает как токсикант для гетеротрофных бак­терий. На 5е сутки при этих концентрациях подавление сменяется достоверным повышением потребления кис­лорода. Это превышение идет, скорее всего, изза нали­чия недоокисленной органики в первые 5 суток опыта.

Полуэффективная концентрация (пороговая), уста­новленная регрессионной интерполяцией, составила величину 0,06 мг/л..

Концентрация 0,01 мг/л в первые сутки постановки опыта и на 5 день давала показатели, близкие к контро­лю. Эту концентрацию можно считать допустимой.

С учетом этих результатов было поставлено более длительное испытание.

Учитывая то, что в предварительном опыте пока­зана высокая токсичность метиленового синего при концентрации 1,0 мг/л, эту концентрацию в основном опыте в спектр исследуемых мы не включали, что по­зволило снизить спектр исследуемых концентраций до 0,005 мг/л.

Изменение БПК5 исследовали в растворах фототок­сиканта сразу после постановки опыта, в первые сутки, третьи, пятые и на 7 сутки при концентрациях метиле­нового синего: 0,5; 0,1; 0,05; 0.01 и 0,005 мг/л. (Более дли­тельное испытание дано в табл. 2.2.)

Выделены результаты, достоверно отличающиеся от контроля по критерию Стьюдента (Р≤0,05; tst= 2,1).

Анализ результатов, приведенных в таблице, пока­зывает, что метиленовый синий в концентрациях от 0,5 до 0,05 мг/л, взятых в день постановки опыта и в по­следующие дни, оказывает статистически достоверное влияние на процесс БПК5. Начиная с 3 суток снижение БПК5 сменяется стимуляцией. Это может объясняться либо формированием адаптации к метиленовому сине­му сообщества сапрофитов, либо быстрой деградацией фотосенсибилизатора в растворе и утилизацией оста­точной органики.

В качестве пороговой концентрации метиленового синего, влияющего на процесс БПК5 (с учетом регрес­сионной интерполяции), в основном опыте может быть принята величина равная 0,06 мг/л.

При концентрации метиленового синего 0,01 мг/л по­давление процесса БПК5 не происходит. Эта концентра­ция метиленового показателя синего может быть приня­та в качестве максимальной допустимой для БПК5.

2.1.2. Влияние растворов метиленового синего на динамику роста гетеротрофных бактерий

Численность сапрофитных бактерий, определяемых по количеству колоний, выросших на МПА 10 после ин­кубации в термостате, подсчитывали в день постановки опыта, а также на 1, 3, 5 и 7 сутки. Динамику роста бак­терий исследовали при тех же концентрациях, которые применялись при определении действия метиленового синего на процессы нитрификации и аммонификации. Данные о влиянии метиленового синего на численность гетеротрофных бактерий представлены в табл. 2.3.

Отличие о контроля достоверно (выделено жирным шрифтом) (Р≤ 0,05; tst=2,45)

Метиленовый синий в концентрациях 0,1 и 0,05 мг/л подавляет рост сапрофитных бактерий, особенно при наивысшей исследованной концентрации, и в некото­рых случаях количество клеток в 1 мл раствора падает на два порядка по сравнению с контролем. При концен­трации 0,05 мг/л метиленовый синий на 7 сутки не про­являет бактерицидного действия. По всей видимости, к этому времени он полностью. инактивируется как фо­тотоксикант. Таким образом, пороговой концентрацией сразу после внесения фотосенсибилизатора следует считать концентрацию 0,05 мг/л.

За максимально допустимую концентрацию мети­ленового синего, не влияющую на динамику прироста сапрофитных бактерий, следует принять концентрацию 0,01 мг/л.

3.2. Влияние профлавина на БПК5

Как и при исследовании метиленового синего опыты с профлавином проводились в двух сериях с различаю­щейся продолжительностью. В предварительном опыте были взяты следующие концентрации профлавина 1,0; 0,5; 0,1; 0,05 и 0,001 мг/л.

Изменение БПК5 исследовалось в растворах токси­канта сразу после постановки опыта и на 5 сутки по­сле постановки опыта. 

Выделенные жирным шрифтом значения, статистиче­ски достоверно отличающиеся от контроля по критерию Стьюдента (Р ≤ 0,05)

Анализ результатов, приведенных в таблице, сви­детельствует о том, что вещество в концентрациях 0,1 мг/л и выше в первый день опыта достоверно снижает БПК5 и выступает как токсикант для гете­ротрофных бактерий. При экспозиции растворов на свету в течение 5 дней угнетение потребления кислорода сменяется стимуляцией, и в склянках для определения БПК отмечается повышенное потре­бление кислорода. Регрессионной интерполяцией установлена пороговая концентрация, вызывающая отклонение БПК более чем на 20%, она составляет 0,08 мг/л.

Концентрации 0,05 и 0,01 мг/л на первый и пятый день после постановки опыта не вызывают статистиче­ски достоверных отклонений показателя БПК5 по срав­нению с контролем.

С учетом этих результатов было поставлено более длительное испытание (данные о влиянии различных концентраций профлавина на изменение БПК5.

Изменение БПК5 исследовали в растворах фототок­сиканта сразу после постановки опыта, в первые сутки, третьи, пятые и на 7 сутки при тех же концентрациях профлавина, что и в предварительном опыте.

Шрифтом выделены значения показателя, достовер­но отличающиеся от контроля (Р≤0,05; tst= 2,1)

Анализ результатов, приведенных в таблице, показы­вает, что профлавин в концентрациях от 0,1 и выше ока­зывает существенное, статистически достоверное вли­яние на процесс БПК5. Экспозиция растворов на свету в течение 7 дней приводит к исчезновению угнетающего эффекта, что, очевидно, связано с деградацией вещества в растворах. При концентрации 0,1 мг/л угнетение пере­ходит к стимуляции, что может быть обусловлено при­сутствием дополнительного органического вещества, переставшего быть токсичным.

За максимально допустимую, не вызывающую изме­нений процесса БПК5 следует рекомендовать концен­трацию 0,05 мг/л.

3.2.2. Влияние растворов профлавина на динамику роста гетеротрофных бактерий

Численность сапрофитных бактерий, определяемых по количеству колоний, выросших на МПА после инку­бации в термостате, подсчитывали в день постановки опыта, а также на 1, 3, 5 и 7 сутки. 

Отличие о контроля достоверно (выделено жирным шрифтом) (Р≤ 0,05; tst=2,45)

Профлавин в концентрациях 0,5 и 1,0 мг/л вызыва­ет подавление роста сапрофитных бактерий. При кон­центрации профлавина 1,0 мг/л отмечается угнетение прироста сапрофитных бактерий на протяжении всего опыта. При концентрации 0,5 мг/л ингибирование роста бактерий и бактерицидные свойства фотосенсибили­затора проявляются в течение пяти дней. Более низкие концентрации профлавина не влияют на динамику роста сапрофитных бактерий.

За допустимую концентрацию, не влияющую на коли­чество микроорганизмов в растворах профлавина, сле­дует принять 0,1 мг/л.

Заключение

Таким образом, сравнительный анализ токсичности метиленового синего и профлавина при фотодинамическом воздействии показывает, что метиленовый синий при меньших концентрациях, чем профлавин проявля­ет фототоксичность для сапрофитных бактерий в воде из природного водоема (допустимая концентрация для метиленового синего по таким показателям как измене­ние БПК5 и прирост бактерий в мл прудовой воды ока­залось одинаковой. равной 0,01 мг/л, а для профлавина соответственно 0,05 и 0,1 мг/л). С точки зрения фототок­­сичности веществ для обеззараживания воды в больших объемах экономически выгодно применять метилено­вый синий. Оба исследованных фотосенсибилизатора могут воздействовать на гетеротрофных бактерий при достаточно низких концентрациях, что является также одним из преимуществ из применения в фотодинамиче­ском обеззараживании и очистки воды от биологическо­го загрязнения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Снегирев Д.В., Карепина Т. А. Перспективность использования профлавин ацетата для обеззараживания воды в отношении колифагов в условиях есте­ственного микробиоценоза поверхностных водоемов// Перспективы науки. № 7 (58), 2014. С. 15–18.
2. Шабанов П. Д. Антисептики нового поколения, фармакология катапола и родственных соединений// Обзоры по клинической фомакологии и лекарствен­ной терапии. 2002, Т. 1, № 2, С. 64–72.
3. Drabkova M., Marsalek B., Admiraal W. Photodynamic therapy against cyanobacteria// Environ Toxicol. 22 (1): 2007. 112–115.
4. Kussovski V. K., Hristov A. E., Radoucheva T. S. (). Proflavinemediated inactivation of Salmonella dublin exposed to visible sunlight in natural fresh water// Microbios. 105 (411): 2001, р. 119–125.
5. Кузнецова Н.А., Калия О. Л. Фотодинамической обеззараживание воды// Химический журнал. Том: LVI. № 2, вып. 1 , 2013. С: 100–109.
6. Ипатова В. И., Прохоцкая В. Ю., Дмитриева А. Г. Исследование токсичности веществ — сенсибилизаторов фотодинамического обеззараживания водной среды в двухвидовой тестсистеме // Материалы Международной научной конференции Современное состояние водных биоресурсов и экосистем мор­ских и пресных вод России: проблемы и пути решения. — РостовнаДону, 2010. — С. 86–92.
7. Оганесова Е.В., Филенко О. Ф. Сравнительная токсичность азиновых красителей для брюхоногих моллюсков Рlanorbis corneus // Токсикологиче­ский вестник, № 6, 2012, С. 43–48.
8. Филенко О.Ф., Исакова Е. Ф., Самойлова Т. А., Гершкович Д. М. Действие тиазинового красителя метиленового синего на дафний. //Токсикологический вестник, № 5, 2011. С. 53–56.
9. Методические указания по установлению эколого–рыбохозяйственных нормативов (ПДК и ОБУВ) загрязняющих веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение. М.: ВНИРО, 1998, 145 с.
10. Платонов А. Е. Статистический анализ в медицине и биологии. Задачи, терминология, логика, компьютерные методы. М.: РАМН, 2000. 51 с.